Полимеразная цепная реакция: 9 важных объяснений

Содержание

Что такое полимеразная цепная реакция?

Полимеразной цепной реакции (ПЦР) - еще один широко используемый молекулярная биология метод ферментативного производства ДНК без использования клеточного аппарата, например дрожжей или E. coli. Метод позволяет ограниченное количество ДНК быть усиливается несколько складок резко. ПЦР регулярно используется в клинический, судебныйи биологические лаборатории для различных целей, например, для определения генетические отпечатки пальцев, диагностика болезни, клонирование генов, и тестирование на отцовство. 

Эта техника была создана в 1983 году Кэри Маллис. ПЦР в настоящее время является важной и важной процедурой, используемой в прикладной биологии. Они включают Клонирование ДНК для секвенирования, филогении на основе ДНК или активного исследования экспрессии генов и определения заболеваний, передающихся генетически. В 1993 году Муллису была присуждена Нобелевская премия по химии за его работу по ПЦР. 

ПЦР обычно проводят в реакционной смеси общим объемом 0.1-0.2 мл в реакционных пробирках (объемы 0.2-0.5 мл) в приборе, известном как термоциклер. Термоциклер нагревает и охлаждает ДНК для достижения температур, необходимых на каждой стадии реакции. Тонкостенные реакционные трубки обеспечивают желаемую теплопроводность, что позволяет быстрее установить тепловое равновесие. Обычно термоциклеры имеют нагретую верхнюю часть или крышку, которая предотвращает конденсацию компонентов реакции в верхней части трубки. 

Требования к полимеразной цепной реакции

• ДНК фрагмент для амплификации (матричная ДНК или кДНК)
• праймеры (прямой праймер и обратный праймер), способные распознавать концы матричной ДНК. Праймеры обычно имеют длину 18-25 пар оснований.
• термостабильный ДНК-полимераза (Полимераза Taq) катализирует синтез ДНК. Полимераза Taq получается из Водяной термус.
• Нуклеотиды
• буфер (обеспечивает оптимальную среду для активности термостабильной ДНК-полимеразы)

Принцип работы полимеразной цепной реакции

ПЦР называется цепной реакцией, потому что вновь синтезированные цепи будут действовать как матрица для дальнейшего синтеза ДНК в последующих циклах. 

ПЦР состоит из 3-х последовательных реакций:

• Денатурация ДНК: Процесс денатурации разделяет нити двухцепочечной ДНК. Для ДНК человека температура денатурации составляет около 93-95°С. Денатурация ДНК осуществляется путем разрыва водородных связей между двумя полинуклеотидными цепями ДНК. Процесс денатурации часто выполняется в течение 5 минут или более продолжительного времени, чтобы гарантировать, что обе нити матричной ДНК полностью отделены друг от друга. Процесс денатурации также активирует термостабильную ДНК-полимеразу.
• Отжиг праймера: После денатурации в реакционную смесь вводят прямой и обратный праймеры. Затем раствор охлаждают для отжига праймера. Обычно отжиг праймера происходит между 50-70 ° С.^oC в зависимости от Tm (температуры плавления) ДНК. В идеале температура отжига 5^oC ниже Tm. Температура отжига должна быть низкой, чтобы образовался гибрид между праймером и ДНК-матрицей, и достаточно высокой, чтобы предотвратить появление несовпадающих гибридов. Tm ДНК зависит исключительно от содержания GC и AT в ДНК. Отжиг праймера обычно занимает 1-2 минуты. Tm можно определить экспериментально или рассчитать теоретически по формуле, указанной ниже:

Tm = [4 x (G + C)] + [2 x (A + T)]^oC

• Синтез ДНК: Термостабильная ДНК-полимераза (Taq-полимераза) связывается вблизи Область связывания РНК и включает свободные нуклеотиды удлинять и синтезировать новую цепь ДНК, примыкающую к матричной цепи. Оптимальная температура стадии удлинения зависит от типа используемой полимеразы; для полимеразы Taq оптимальная температура составляет около 72^oC. Продолжительность этой стадии удлинения зависит от длины матричной ДНК и эффективности термостабильной ДНК-полимеразы; обычно это одна пара килобаз в минуту.

Все упомянутые выше реакции повторяются 30 раз, чтобы получить примерно 1 миллиард копий ДНК-матрицы.

Этапы полимеразной цепной реакции

Процесс ПЦР делится на три этапа:

• Экспоненциальное усиление: ДНК-полимераза выполняет оптимальную функцию, и после завершения каждого цикла количество продукта удваивается. Только небольшое количество ДНК должно присутствовать в начальной точке реакции, поскольку реакция очень чувствительна.
• Стадия выравнивания: ДНК-полимераза проявляет меньшую активность из-за меньшей доступности таких реагентов, как нуклеотиды.
• Плато: продукт больше не образуется из-за исчерпания реагента.

Использование полимеразной цепной реакции

ПЦР может использоваться для выявления многочисленных аномалий, связанных с геномом, широкого спектра анализов и экспериментов. Несколько примеров использования ПЦР обсуждаются ниже:

• Выявление в образце инфекционных агентов, таких как ЦМВ, микоплазма, пневмония, инфекционные заболевания и заболевания, связанные с простейшими, гепатит и т. Д.
• Определение злокачественных новообразований, особенно в случае лимфомы и лейкемии. 
• Проверка на отцовство и генетическая дактилоскопия. 

ПЦР позволяет на раннем этапе выявить аномалии, которые в настоящее время являются наиболее развитыми в онкологических исследованиях. Измерения ПЦР можно проводить непосредственно на образцах геномной ДНК для распознавания транслокационно-специфических злокачественных клеток с чувствительностью более чем в 10,000 XNUMX раз по сравнению с любым другим методом. 

ПЦР также позволяет идентифицировать некультивируемые и медленнорастущие микроорганизмы, такие как микобактерии, анаэробные микроорганизмы и вирусы, с помощью методов культивирования тканей и моделей на животных. Показательными приложениями ПЦР в микробиологии являются распознавание патогенов и способность отличать непатогенные штаммы от патогенных путем выявления конкретных генов. 

ПЦР используется для усиления короткого участка цепи ДНК. Эта цепь ДНК может быть полным геном или просто частью гена. В отличие от живых систем, цикл ПЦР может амплифицировать только короткие фрагменты ДНК. до 10 пар килобаз. Различные другие методы позволяют амплифицировать фрагменты ДНК размером до 40 т.п.н., что все же меньше размера ДНК. хромосомная ДНК эукариотического клетка — например, клетка человека содержит около трех миллиардов пар нуклеотидов. 

Отцовское тестирование можно провести с помощью ПЦР, взяв ДНК лиц, имеющих спор. ДНК испытуемых амплифицируют и переваривают. ферменты рестрикции и анализировали с помощью гель-электрофореза. Структура фрагментов ДНК на агарозном геле известна как отпечаток ДНК человека. Тесно или кровнородственные люди будут иметь аналогичный Дактилоскопия ДНК по сравнению с отдаленно связанными или неродственными людьми. Полученные отпечатки пальцев могут быть дополнительно проанализированы на предмет родителя-ребенка или братьев и сестер с двумя или более генетическими (ДНК) отпечатками пальцев. Полученные отпечатки ДНК можно использовать, чтобы узнать эволюционные отношения между организмами. 

Его размер позволяет легко распознать конечный продукт ПЦР на электрофорез в агарозном геле. Электрофорез в агарозном геле проводят путем инъекции образцов ДНК в агарозный гель. Электрический ток пропускается через агарозный гель, чтобы узнать подвижность образцов ДНК. Более мелкие фрагменты ДНК быстрее перемещаются в геле и наоборот. Продукт ПЦР и фрагмент ДНК образца идентифицируют путем введения лестницы ДНК в агарозный гель. Лестница ДНК содержит молекулы ДНК известного размера. 

Раньше идентификация генетического заболевания путем наблюдения за геномом была сложной задачей. Позже, с развитием ПЦР, этот процесс укорачивается. Любой интересующий ген можно легко амплифицировать с использованием подходящих праймеров, а затем секвенировать для обнаружения мутаций в ДНК. Раннее выявление некоторых летальных вирусных инфекций также можно осуществить с помощью ПЦР. 

Типы полимеразной цепной реакции

Основываясь на некоторых подходящих модификациях техники, Полимеразной цепной реакции подразделяется на следующие виды:

• Вложенная ПЦР
• Обратный ПЦР
• Обратная транскрипция (ОТ-ПЦР)
• Асимметричная ПЦР
• Количественный (ПЦР-Q-ПЦР)
• Количественная ПЦР в реальном времени (QRT-PCR)
• ПЦР приземления
• ПЦР колоний
• Аллель-специфическая ПЦР
• Сборка ПЦР или сборка для цикла полимеразы (PCA)
• Асимметричная ПЦР
• Линейный после экспоненциальной ПЦР (LATE-PCR)
• Dial-out ПЦР
• Геликаз-зависимая амплификация
• Горячий старт ПЦР
• ПЦР с межпоследовательностью
• Обратный ПЦР
• ПЦР, опосредованная лигированием
• Метилирование-специфическая ПЦР
• Мини-праймерная ПЦР

Преимущества полимеразной цепной реакции

• Полимеразная цепная реакция может использоваться для идентификации множества генетических аномалий.
• ПЦР используется в широком спектре лабораторных экспериментов и процедур в молекулярной биологии.
• ПЦР может обнаруживать злокачественные новообразования, такие как лейкемия, лимфома и т. Д., А также различные другие состояния, такие как Toxoplasma gondi, стафилококковая бактериемия, малярийные инфекции и т. Д.
• Генетический дактилоскопический анализ и тестирование на отцовство включает в себя ПЦР как их решающий шаг.
• Высокая чувствительность и специфичность ПЦР делает ее важным инструментом для экспериментов на основе биотехнологии и молекулярной биологии.

Недостатки полимеразной цепной реакции

• Полимеразная цепная реакция требует термоциклера, электрофоретической сборки ДНК, набора для выделения ДНК и других дорогостоящих химикатов, которые делают процесс дорогостоящим.
• Требуются обученные, квалифицированные и опытные техники для проведения экспериментов.
• Требуются лаборатории базового уровня безопасности с осушителями и установками с ламинарным потоком.
• Обычной публике сложно позволить себе тестирование на основе ПЦР.
• Не все заболевания можно идентифицировать и диагностировать с помощью ПЦР.
• Возможность получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов.

Выводы:

Полимеразная цепная реакция - это широко используемый и общепринятый метод идентификации нескольких летальных инфекционных агентов с чувствительностью и специфичностью. ПЦР используется в различных передовых медицинских центрах, современных лабораториях и медицинских институтах в качестве стандартного диагностического и исследовательского модуля. Полимеразная цепная реакция играет решающую роль в идентификации аномалий, представляющих атипичные клинические симптомы; ПЦР позволяет раннее выявить эти типы нарушений. Раннее обнаружение может помочь лучше управлять человеком, что может снизить социальную и экономическую нагрузку на его семью.

Чтобы узнать больше о других темах биосинтеза и биотехнологии нажмите здесь.

Проверка концепции MCQ

Вопрос нет. 1: Студент выполняет ПЦР для амплификации образца ДНК-матрицы. Но он забыл добавить праймер для ДНК в эксперименте. Какой из следующих вариантов дает наилучший результат?

A- Реакция не состоится.

B- Реакция будет работать, но процесс будет амплифицировать неспецифические области (не желаемую ДНК-часть ДНК.

C- Реакция будет работать, но с продолжительной скоростью

D-Реакция сработает, и продукт покажет нежелательные мутации.

Вариант: «Реакции не будет» - правильный ответ.

Объяснение: Праймеры необходимы для функционирования ПЦР. Taq-полимераза нуждается в них для связывания (на этапе отжига), чтобы инициировать Репликация ДНК. Таким образом, ПЦР не будет работать без праймеров, и амплификация не произойдет.

Вопрос нет. 2: Студент / исследователь хочет вставить ген гемоглобина человека в вектор экспрессии, чтобы клонировать и экспрессировать ген в клетках мыши для анализа полученного фенотипа. Какая из следующих процедур позволит студенту / исследователю успешно клонировать ген?

Вариант:

1. Усилить ген с помощью ПЦР.

2. Используйте рестрикционный фермент для разрезания вектора экспрессии.

3. Лигируйте ген и расщепленный вектор.

Вариант B: 

1. Лигатный ген

2. Используйте рестрикционный фермент для разрезания вектора экспрессии. 

3. Амплифицировать ген и расщепленный вектор экспрессии с помощью ПЦР.

Вариант C:

1. Используйте рестрикционный фермент для разрезания вектора экспрессии.

2. Усилить ген с помощью ПЦР.

3. Лигируйте ген и расщепленный вектор.

Вариант D:

1. Используйте рестрикционный фермент для разрезания вектора экспрессии.

2. Лигируйте ген и расщепленный вектор.

3. Амплифицировать ген с помощью ПЦР.

Вариант: Это исправить вариант 

1. Усилить ген с помощью ПЦР.

2. Используйте рестрикционный фермент для разрезания вектора экспрессии.

3. Лигируйте ген и расщепленный вектор.

Объяснение: Во-первых, мы будем использовать ПЦР для амплификации интересующего гена из генома человека, имеющего сайты рестрикции на концах (это поможет его лигированию с рестриктазой). переваренный фермент вектор). Позже вектор экспрессии необходимо расщепить с использованием того же рестрикционного фермента, а затем расщепленный вектор и амплифицированный ген лигируют вместе. Конечный продукт будет состоять из двух сегментов: исходного вектора и интересующего гена.

Вопрос нет. 3: Какой инструмент используется для завершения амплификации ДНК с помощью ПЦР?

A- Генетический анализатор

B- УФ-спектрофотометр

C- термоциклер

D- Центрифуга

Вариант C: Термоциклер - правильный ответ

Объяснение: Термоциклер может быть настроен на выполнение цикла стадий денатурации, отжига и удлинения, соответственно, в небольшом объеме реакционного объема. Для проведения ПЦР-амплификации используется термоциклер.

Чтобы узнать больше о продвинутой науке, пожалуйста, подпишитесь на эту ссылку.